杜仲叶（EL）作为一种中草药，具有降脂的生物潜力。经过发酵，EL被制成具有降脂和抗氧化活性的各种产品。然而，发酵杜仲叶（FEL）的抗高脂血症机制目前尚不清楚。我们旨在评价FEL对高脂血症的影响，并从调节肠道稳态和宿主代谢的角度探讨其作用机制；采用高脂饮食喂养Wistar大鼠8周，建立高脂血症动物模型；FEL水提取物（FELE）的给药剂量分别为128、256和512 mg/kg/d；咱们进行了血清生化参数检测、组织病理切片分析、肠道微生物群16S rDNA测序和非靶向粪便代谢组学分析，以确定FELE对高脂血症的治疗效果并预测相关途径；采用免疫荧光（IF）和实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测与脂质相关的蛋白质和基因的变化；采用UPLC-MS对FELE中的56种成分进行了鉴定，其中有机酸、黄酮类化合物和酚酸类成分占大多数。结果显示，FELE的干预明显降低了高脂血症大鼠的体重、脂质积累以及总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，同时升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。同时，FELE改善了炎症因子和氧化应激因子，即肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）。这些根据结果得出，FETE可以大大降低血脂，减轻高脂血症引起的炎症和氧化损伤。从机制上讲，FELE通过降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例和增加益生菌的丰度来恢复肠道微生物群的稳态，特别是乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014-Unclassified，同时通过氨基酸、胆汁酸和脂质相关代谢途径调节代谢。此外，Pearson相关性分析发现，上调的胆红素、苏氨酸、多巴胺和下调的lipocholic acid、d-鞘氨醇是FELE干预后的关键代谢产物。IF和qRT-PCR分析显示，FELE上调脂肪酸氧化蛋白和基因（PPARα，CPT1A）、胆汁酸合成和排泄蛋白和基因的表达（LXRα，CYP7A1，FXR），并通过调节肠道微生物群下调脂肪生成基因（SREBP-1c）的表达，以改善代谢并发挥降脂作用。这项工作填补了FEL降脂机制的空白。FELE能够最终靠调节肠道微生物群的稳态和代谢来改善HFD诱导的高脂血症。因此，FEL具有发展成为新型降脂药物的潜力。

  译名：发酵杜仲叶水提物通过维持肠道稳态和调节代谢来缓解高脂饲料喂养大鼠的高脂血症

  我们在FELE鉴定出56种单体，如图2和表1所示。其中有机酸17种，黄酮类14种，酚类和酚酸类11种，环烯醚萜类3种，生物碱3种。绿原酸、咖啡酸、peltatoside、芦丁、槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素、13（S）-HOTrE、9（S）HOTrE和9-HODE在FELE中含量较高。与EL的先前报告相比，发酵后化学成分的相对含量发生了显著变化，而成分的类别没有显著差异。

  图2 高效液相色谱-质谱联用技术对FELE中的组分进行定性分析。（A）FELE的总离子流图；（B）FELE中主要成分的结构式。

  如图3A、B、C所示，实验结束时，高脂饮食（HFD）组大鼠的体重、肝脏和脂肪指数明显高于正常饮食（ND）组（p0.01），FELE组和血脂康胶囊（XZK）组的体重明显低于HFD组（p0.01），FELE-H组和XZK组的肝脏指数和脂肪指数明显低于HFD组（p0.05）。HFD组大鼠的脂肪大约是ND组的1.83倍。低、中、高FELE组的脂肪含量分别是ND组的1.46倍、1.29倍和1.13倍。因此，经常使用FELE能够大大减少高脂血症大鼠的脂肪积累。

  血清脂质水平显示FELE可显著改善HFD引起的高脂血症。如图3 D-M所示，与HFD组相比，高剂量FELE可明显降低血清TC（p0.01）、TG（p0.05）、LDL-C（p0.01）水平，并非常明显升高HDL-C（p0.01）。长期喂食HFD会导致大鼠体内炎症因子失衡，导致代谢紊乱。HFD组血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平明显高于ND组（p0.01）。ZXK组和FELE组均抵消了HFD引起的炎症因子水平的升高（p0.01）。MDA含量是肝脏脂质过氧化的指标，而SOD和CAT则表明肝脏的抗氧化能力。根据结果得出：FELE-M和FELE-H喂养大鼠后MDA含量显著下降（p0.01），而SOD（p0.01）和CAT（p0.01）水平非常明显升高，可减轻肝脏脂质氧化反应。

  我们用H&E染色切片观察肝脏和脂肪组织的结构伤害损坏。如图4A所示，与ND组相比，HFD组的中心静脉出现空泡变性，肝细胞充满脂肪滴。这些组织学变化在给予FELE和XZK后恢复。肾周脂肪的H&E染色切片如图4B所示。ND组脂肪细胞排列规则紧密，细胞大小均匀，而HFD组脂肪细胞明显膨胀，严重变性，排列不规则。FELE和XZK给药后，脂肪细胞体积减少，同一视野内的脂肪细胞数量增加，细胞排列相对紧凑和规则。FELE-H组的脂肪细胞体积接近ND组。油红O染色后（图4C），HFD组大鼠肝细胞充满红色染色，而给予FELE和XZK后，红色染色的比例下降。

  图4 FELE摄入对肝脏和脂肪组织的影响。（A）肝细胞的H&E染色切片。HFD组大鼠肝细胞损伤严重。黑色箭头表示肝细胞中充满了脂肪滴，而红色箭头则表示肝细胞大量空泡变性。（B）脂肪组织。箭头表示明显肿胀，HFD组中脂肪组织的不规则排列、严重变性。（C）肝细胞的ORO染色切片（放大倍数，200，比例尺：50μm）。

  我们采用16s rDNA对ND、HFD和高剂量FELE组的肠道微生物群进行测序，在选择有效读取之后，总共生成了1292188个有效读取。扩增子序列变异（ASV）经过数据过滤和去复制后进行计数，能大大的提升数据的准确性和物种的分辨率。维恩图（图5A）直观地说明了各组共同和独特的ASV丰度。Alpha多样性指数（表S3）用于评估肠道微生物群的多样性和丰富度。HFD组的Chao1、Shannon、Simpson和Pielou均匀度与ND组相比显而易见地下降（p0.05），而FELE组的这些指标增加，其中Chao1和Shannon的变化具有统计学意义（p0.05）。在基于UniFrac的PCoA中，ND、HFD和FELE组之间有明显的分离（图5B），这表明每组的肠道微生物群组成是单独聚集的，FELE能改变HFD大鼠的肠道微生物组组成。根据结果得出，FELE能提高群落丰度、群落多样性和群落均匀性。

  图5 FELE对高脂血症大鼠粪便微生物群的影响。（A）维恩图显示了ASV的重叠，（B）基于UniFrac的PCoA，（C）门水平的相对丰度，（D）厚壁菌门与拟杆菌门的比例，（E）属水平的相对丰度，（F）对HFD有反应的变化属与高脂血症相关指数的相关性。*r0.5，p＜0.05；**r0.5和p0.01。（G），（H）通过线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）鉴定ND、HFD和FELE中的大多数特征分类群。数据表示为平均值±标准差（n=6)。与ND组比较，**p＜0.01。与HFD组相比，#p＜0.05。

  通过物种分析，各组之间的优势肠道微生物群物种水平不同。在门水平上，主要鉴定出厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和疣微菌门，其中厚壁菌和拟杆菌门是相对丰度最高的优势细菌（图5C）。如图5D所示，HFD组的F/B比率明显高于ND组（p0.01），这与相关论文的结果一致。FELE组的F/B比值明显降低（p0.05），变形菌丰度降低，但无显著差异。在属水平上，我们对丰度最高的15种细菌进行了分析（图5E）。HFD组的Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_unclassified的丰度明显低于ND组（p0.05）。FELE组乳杆菌、Rombousia、罗氏菌的丰度明显高于HFD组（p0.05）。此外，HFD组瘤胃球菌、Clostridiales_unclassified和阿克曼菌的丰度高于ND组，FELE干预后下降。这些根据结果得出，FELE可以明显影响HFD大鼠肠道微生物群的组成。

  我们计算了丰度变化显著的前15个属与高脂血症相关指数的相关性。结果显示为热图（图5F）。有6种细菌与三种以上的高脂血症相关指标相关，这些指标以红框表示。结合属的丰富性，瘤胃球菌、乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_Unclassified可能是FELE改善大鼠高脂血症的靶点。

  我们通过LEfSe分析，对微生物群落做多元化的分析，以确定与不同饮食干预相关的最显著的不同肠道微生物类群。如图5G和H所示，我们在3个类群中发现了10个丰富的差异分类群，包括4个属。在属水平上，FELE类群包含Bacilli和梭状芽孢杆菌属的优势属。但是，相反，HFD组毛螺菌为其优势菌。这些细菌的变化可能揭示了HFD诱导的高脂血症的发病机制。FELE组以拟杆菌为特征，表明FELE可能通过影响拟杆菌的丰度来改善HFD诱导的肠道疾病。

  为了研究FELE对HFD大鼠代谢的影响，我们采用非靶向LC-MS以正离子和负离子模式鉴定ND、HFD和FELE-H组的粪便代谢产物。各组OPLS-DA分析的R2和Q2参数相比来说较高，验证了该模型拥有非常良好的预测能力和可靠性（图6）。为了筛选差异代谢物，我们去除了未注释的成分和重复成分。倍数变化2或1/2、VIP值1和P值0.05的代谢产物被视为差异代谢产物。与ND组相比，有303种代谢产物因HFD而发生明显的变化，其中108种上调，195种下调。与HFD组相比，FELE干预后有86种代谢产物发生明显的变化，其中44种上调，42种下调。差异代谢物的信息列于补充表S4、S5中。HFD组有21种差异代谢产物可以被FELE逆转，这应该是研究的重点，如表S6所示。随后，我们分析了不同代谢物的KEGG途径（图7）。根据结果得出，HFD可能通过以下途径影响大鼠的代谢：胆汁分泌、酪氨酸代谢、次级胆汁酸生物合成、色氨酸代谢。烟酸和烟酰胺代谢、不同环境中的微生物代谢、酪氨酸代谢、胆汁分泌、组氨酸代谢可能是FELE调节高脂血症大鼠脂质代谢的重要途径。

  图6 FELE改变了肠道代谢物谱。(A)偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和(B)正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)评分图。

  图7 基于KEGG途径数据库的代谢途径分析。（A）ND与HFD，（B）FELE与HFD。

  为了揭示肠道微生物群与FELE干预后逆转的代谢产物之间的关系，我们通过Spearman相关性分析了6个高脂血症相关属，瘤胃球菌属、乳杆菌属、Rombousia、拟杆菌属、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_unclassified和24种反向代谢产物（图8）。根据结果得出，乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、Clostridia_UCG-014_unclassified对代谢产物有相似的影响，并与胆红素、苏氨酸和多巴胺的变化呈正相关。Ruminocus与石胆酸（LCA）和d-鞘氨醇的变化呈正相关。有5种代谢产物与三个以上的高脂血症相关属相关，以红框表示。筛选出的5种代谢产物主要涉及氨基酸、胆汁酸和脂质相关代谢。绘制的直方图直观地显示了FELE干预前后代谢物的变化（图9）。

  图8 高脂血症相关属FELE与FELE逆转代谢产物的相关性。*r0.5，p＜0.05；**r0.5，P＜0.01。右侧显示了与代谢物相对应的代谢途径。

  图9 FELE干预高脂血症大鼠后，5种差异代谢产物的相对含量显著逆转。数据表示为平均值±标准差（n=6)。与ND组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。与HFD组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。

  HFD引起的肝脏脂质代谢紊乱对高脂血症的发展至关重要。为了探讨FELE降脂作用的潜在机制，我们对肝组织进行了免疫荧光染色，并用qRT-PCR检测了5个脂质代谢相关基因。IF结果为，补充FELE可明显提高LXRα、CYP7A1、PPARα、CPT1A的表达水平，促进BA的合成和排泄，降低胆固醇和FA（图10 A和B）。qRT-PCR结果证实，HFD组胆汁酸合成和排泄（CYP7A1、FXR、PPARα）以及脂肪酸氧化基因（CPT1A）的mRNA水平显著下调，而脂肪生成基因SREBP-1c的mRNA水平与正常组相比显著上调。在FELE组中，CYP7A1、FXR、PPARα、CPT1A的表达水平高于HFD组，而SREBP-1c的表达水平低于HFD组（图10C）。

  图10 FELE通过调节参与脂质代谢途径的蛋白质/基因对降脂的影响。（A）IF染色法测定肝组织中LXRα、CYP7A1、PPARα、CPT1A的含量。（B）通过Fiji ImageJ对相对荧光强度进行统计分析。数据表示为平均值±标准差（n=5)。与ND组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。与HFD组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。（C）FELE对肝脏脂质代谢基因表达水平的影响。数据表示为平均值±标准差（n=6)。与ND组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。与HFD组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。（D）FELE的降脂机制。FELE通过减少脂质合成、增强脂质氧化、胆汁酸合成和排泄，在降脂中发挥作用。

  之前的一项研究显示了与本研究类似的结果，即微生物固体发酵后红茶中的茶褐素、没食子酸和含量明显地增加，显著改善了斑马鱼的高脂血症。现代药理学研究表明，环烯醚萜类化合物、酚酸和黄酮类化合物具有非常明显的降脂活性。UPLC-MS数据表明，FELE富有丰富的绿原酸、京尼平苷酸、咖啡酸、peltatoside和多种有机酸，可能是其抗高脂血症的活性成分。长期补充含有活性成分的食物有利于改变肠道微生物群的组成，可用于预防高脂血症。发酵产品具有独特的降脂优势，增加了活性成分的含量，减少了毒副作用。因此，FELE在抗高脂血症过程中对肠道微生物群和代谢的调节作用值得探讨。

  HFD喂养8周成功诱导大鼠高脂血症，症状与有关报道一致。喂食FELE后，体重、肝脏和脂肪指数显著下降。同时，FELE干预后HFD大鼠血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平可逆转。大量脂肪的积累明显地增加TG和TC，并导致脂毒性和肝脂肪变性。长期保持高水平的TG或TC很容易增加中风、动脉粥样硬化和心血管疾病的风险，而正常水平的HDL-C能保证胆固醇反向转运，促进胆固醇降解，降低患心血管疾病的概率。因此，补充FELE可以大大降低血脂水平，降低并发症的发生率。FELE可以显著逆转HFD喂养引起的炎症因子的上调，缓解炎症状态。已经证实，肥胖状态会影响身体代谢并诱导低度炎症，TNF-α和IL-6是炎症细胞因子，在炎症过程中传递信号并诱导细胞凋亡，而MCP-1能加强其他炎症因子的表达。此外，FELE通过降低血清MDA水平、增加SOD和CAT来改善氧化损伤。HFD大鼠体内脂肪的积累加剧了氧化应激，导致脂肪细胞因子失衡，进而诱发早期代谢综合征。因此，补充FELE可以明显降低高脂血症大鼠的炎症和氧化应激，维持肠道屏障，确保正常代谢。H&E染色和ORO染色结果为，FELE显著改善了HFD引起的肝空泡变性和脂肪组织病理性肿胀，并减少了脂肪滴的数量。因此，FELE干预能减轻肝损伤和脂质积聚，缓解炎症和氧化应激。这些有益效果可能部分归因于发酵后EL中某些生物活性成分的转化和富集。

  在本研究中，喂食FELE的高脂血症大鼠肠道微生物群的丰度明显地增加。在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是优势细菌。FELE干预能明显降低高脂血症大鼠的F/B比值。多项数据表明，F/B比值的显著升高预示着肥胖或高脂血症的发生。在FELE干预后，变形杆菌的丰度下降，表明FELE能够大大减少肠道中致病菌的积累。变形杆菌中含有多种致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等。变形杆菌失衡可能会引起肠炎、肠道应激综合征和代谢性疾病。属和药效学指标的Spearman相关性分析表明，FELE可以显著逆转乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、Roseburia、Clostridia_UCG-014_Unclassified的丰度。LEfSe分析结果还表明，毛螺菌是HFD组的优势细菌，而FELE干预后拟杆菌的丰度增加。先前的研究表明，肥胖和非酒精性脂肪肝患者的瘤胃球菌和毛螺菌丰度增加，与肠道应激综合征呈正相关，并诱发其他代谢性疾病。然而，乳杆菌能改善肠道健康，调节脂肪细胞因子，并降低喂食HFD的大鼠的胆固醇水平。Rombousia丰度的增加与肥胖相关指标呈负相关，影响肠道脂质代谢水平。拟杆菌可能促进棕色脂肪中支链氨基酸的分解代谢，以防止饮食诱导的肥胖。罗氏菌可以产生丁酸盐，刺激Treg细胞分化，并在抵抗肠道炎症中发挥作用。Clostridia_UCG-014_Unclassified可能与高脂血症及其引起的脂肪肝疾病的改善紧密关联。因此，研究结果证实，FELE通过降低F/B和调节其他肠道细菌的丰度来重塑高脂血症大鼠肠道微生物群的稳态，以调节肠道微生物群为靶点，达到抗高脂血症的目的。

  大多数生活在消化道中的微生物产生或修饰各种化学物质，或引发宿主反应，影响新陈代谢和其他生理活动。在本研究中，宿主的氨基酸、胆汁酸和脂质相关代谢会受到肠道微生物群的影响。16S测序与代谢组学的相关性分析表明，拟杆菌和瘤胃球菌与多种代谢产物有很强的相关性。为了阐明FELE的降脂途径，我们通过IF和qRT-PCR检测胆汁酸合成和排泄、脂肪酸氧化和脂质合成的蛋白质和基因变化。相关的蛋白质/基因途径如图10D所示。LXRα可以激活胆汁酸合成经典途径中的限速酶（CYP7A1），促进胆固醇向BAs的转化。生成的CA和CDCA与牛磺酸（T）或甘氨酸（G）结合，并激活FXR以诱导胆盐输出泵（BSEP）将初级胆汁酸（PBAs）排出到胆汁中。PBAs通过胆管分泌到肠道中，并在肠道微生物群酶的作用下形成次级胆汁酸（SBA）。在回肠的肠细胞中，SBAs通过顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT）被重新吸收，并通过肠胆汁酸结合蛋白（IBABP）和有机溶质转运蛋白α/β（OSTα/OSTβ）二聚体分泌到门静脉血中。循环中的SBAs进一步被肝脏钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）吸收并结合到肝脏胆汁酸池中，完成BA的肝肠循环。胆汁酸池的稳态取决于肠道微生物群的代谢，这对BAs的生物功能具备极其重大意义。此外，PPARα可激活CPT1A，促进脂肪酸氧化。随着FXR的激活，PPARα还能够在一定程度上促进下游基因LXRα和CYP7A1的表达，从而启动胆汁酸的合成。在胆固醇反向转运方面，PPARα和LXRα的下游基因ABCA1可以将胆固醇转运到细胞外基质并结合ApoA-I，这伴随着高密度脂蛋白水平的升高。本研究之后发现，FELE上调FXR、LXRα和CYP7A1的表达，可促进胆固醇向BAs的转化，防止胆汁淤积。同时，FELE激活PPARα和CPT1A，促进FA的氧化和分解，诱导胆固醇反向转运，减少胆固醇积累。最后，SREBP-1c是一个关键的脂肪生成因子，调节甘油三酯和脂肪酸的合成。SREBP-1c的上游基因FXR/SHP可抑制脂质合成途径，加速脂肪酸β氧化。在本研究中，FELE能够下调SREBP-1c的表达，抑制脂质合成。对粪便中不同代谢产物的分析表明，HFD组大鼠粪便中的LCA水平异常升高。这种病理状态可能是由长期HFD中胆汁酸二次吸收途径异常、胆汁酸池稳态破坏和胆汁酸合成途径受阻引起的。流行病学研究表明，HFD受试者粪便中的LCA水平升高。与本研究一致的是，一些研究根据结果得出，摄入植物甾醇或多酚可以有效缓解HFD喂养动物LCA的增加，并降低TC和TG的含量。此外，FELE组的苏氨酸和胆红素水平明显高于HFD组。肠道微生物群的显著变化改变了宿主血清和粪便中氨基酸的代谢，这一点已通过粪便微生物群移植实验得到证实。添加苏氨酸的饮食可以显著抑制脂肪生成基因SREBP-1c，并激活脂肪酸氧化基因CPT1A的表达，从而改善脂质代谢。此外，胆红素可以激活PPARα，减少肝脏脂质的积累。在本文中，FELE的干预不仅提高了胆红素水平，而且与拟杆菌丰度的调节有关。差异代谢产物的结果还显示多巴胺和d-鞘氨醇发生了显著变化。在能量稳态方面，肥胖者的多巴胺水平和/或功能下降。长期暴露于HFD会减少伏隔核（NAc）中D1和D2受体以及多巴胺转运蛋白的数量，由此产生低多巴胺能状态。此外，肠道微生物群影响与多巴胺代谢高度相关的内在酶活性。因此，推测FELE可能通过影响菌群肠-脑轴来降低HFD大鼠的高脂血症，进而影响多巴胺的代谢。一些研究数据还表明，代谢异常的肥胖大鼠的d-鞘氨醇含量明显地增加。d-鞘氨醇的变化可能会引起鞘脂代谢紊乱，诱发2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎等代谢综合征。

  目前的研究提供了足够的证据，表明FELE显著抑制HFD大鼠高脂血症的发展（图11）。我们通过16S基因测序和代谢组学的关联分析预测代谢途径的变化，并评估肝脏中脂质代谢蛋白/基因表达的变化。FELE通过调节肠道微生物群的丰度来缓解高脂血症，如瘤胃球菌、乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_Unclassified。此外，FELE激活FXR/PPARα/LXRα/CYP7A1信号通路，并调节内源性代谢产物的丰度，以调节脂质代谢紊乱。未来，从FELE中分离的活性成分将用于探索其在大鼠和细胞中的降脂作用和机制，并进一步验证FELE缓解高脂血症的靶点。这项研究为发现治疗高脂血症的有益药物或补充剂提供了思路。

  图11 FELE在减轻HFD诱导的高脂血症和调节肠道微生物群和代谢中的作用示意图

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